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每年，約有280，000名患者接受機械或生物假體心臟瓣膜移植。20 雖然這些是救生設備，但這些假肢缺乏生長潛力是兒科患者的一個主要問題。他們必須經歷多次分階段的干預，以適應增加的環空尺寸，并增加發病率和死亡風險。22 因此，迫切需要具有持續一生的生長能力的心臟瓣膜假體。3，21
去細胞化組織工程心臟瓣膜 （DTEHV） 可能是一種有前途的替代方案。從我們的第一個長期體內實驗中，我們將DTEHV植入綿羊和非人類靈長類動物中，我們了解到DTEHV在5小時后開始重新填充，伴隨著植入8周后細胞外基質的變化。此外，隨著時間的推移，ECM的產生表明組織再生和生長潛力。6，30 這與去細胞化的異源性心臟瓣膜相反，后者僅顯示有限的宿主細胞再填充。7，13 此外，這些DTEHV可以現成提供。5 雖然這些結果很有希望，但有小葉縮短和小葉與壁融合的跡象，最終導致瓣膜功能不全，其他組也報告了這種效果。8，10 關于這個傳單引信和縮短問題的解釋可以在閥門幾何形狀中找到。從Loerakker等人15的計算模擬中可以看出，當在生理肺壓下加載時，這種原始瓣膜設計中的小葉在徑向方向上受到組織壓縮。這也許可以解釋為什么這種特殊的瓣膜幾何形狀與浸潤的宿主細胞誘導的重塑相結合，最終導致小葉尺寸減小?；谶@些發現，Loerakker等人還提出了一種改進的瓣膜幾何形狀，該幾何形狀應該能夠在血液動力學加載期間徑向小葉延伸，以抵消細胞縮回力。這需要更深的腹部曲率，增強的凝固區域以及主要是圓周膠原取向。15 然而，迄今為止，在培養過程中控制組織工程心臟瓣膜（TEHV）的幾何形狀是有限的。無論支架起始基質的初始形狀如何，組織壓實發生在所有可能的無約束方向上，以響應用于培養瓣膜的血管衍生細胞（肌成纖維細胞）施加的牽引力。29 這導致小葉結構扁平，培養后無共適配區。12，17
因此，本研究的目的是找到一種解決方案，以便能夠根據計算模擬中建議的幾何形狀改進，施加和維護DTEHV幾何形狀，以減少肺負荷條件下徑向方向的小葉組織壓縮。開發了一種與改進的幾何形狀相匹配的生物反應器插入物，它將在培養過程中作為整體幾何約束。通過這種方式，小葉將在生物反應器插入物周圍壓實自己，并且在去細胞化過程后移除插入物時，DTEHV很可能保持其形狀。這使得設計、施加和維護所需的 DTEHV 幾何形狀成為可能。生產了基于人類細胞的DTEHV，并使用流體動力學和疲勞體外測試評估了其功能和穩定性。利用組織學和共聚焦顯微鏡研究了生物反應器插入物對組織形成和膠原取向的影響。此外，通過力學性質分析，研究組織各向異性程度，并作為計算模擬小葉組織負荷行為的輸入，以分析新設計的DTEHV中的徑向應變分布。
根據Hamid等人的數學描述，原始閥門設計通過添加配合和增加腹部區域的曲率來改進，如Loerakker等人先前所描述的那樣。15該改進的幾何形狀被導出為STEP文件從模擬軟件（美國Abaqus 6.10 Simulia）中導出并導入到計算機輔助設計軟件中（Autodesk Inventor， 美國），以制造一個長度為27.8 mm，直徑為29.7 mm的一體式組件，該組件與舒張壓脈沖復印機（DPD）生物反應器系統兼容。17 生物反應器嵌件由一塊固體聚醚醚酮（PEEK）利用計算機控制的碾磨技術制成。
插入物位于瓣膜的動脈側，以便在各個柱子周圍進行組織壓實。小孔（直徑0.5毫米，間距1毫米）覆蓋插入壁，以促進與相鄰組織的營養交換。頂部有三個大的三角形開口，用于向組織工程瓣膜壁進行介質交換。
如前所述，組織工程心臟瓣膜（TEHV）（n = 5）進行培養。17 簡而言之，從無紡布聚乙醇酸網（PGA，厚度1.0毫米，比重70毫克/厘米）切割三葉心臟瓣膜3;塞隆，盧森堡），縫制（Prolene 6-0，美國奧道康）到徑向自膨脹鎳鈦諾支架（長度= 31毫米，ID = 30毫米在37°C;PFM-AG，德國），并涂有1%聚-4-羥基丁酸酯（P4HB;分子量：1 × 106;美國四氫呋喃（THF;西格瑪-奧爾德里奇，美國）。心臟瓣膜形狀結構的初始坐嬈長度為5 mm，最大橈骨腹部長度為19 mm。將這些構建體用70%乙醇（EtOH，VWR國際S.A.S.法國豐特奈蘇布瓦）滅菌15分鐘，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌3次10分鐘，在抗菌抗真菌溶液中孵育10%青霉素/鏈霉素（Pen/Strep）（比利時龍沙），用0.5%真菌（美國InvivoGen）洗滌30分鐘，并用PBS洗滌3次10分鐘。此后，將閥門在生長培養基（美國吉布科高級杜貝克科的改性鷹培養基）中孵育過夜，并輔以10%胎牛血清（FBS，德國生物染色），1%筆/鏈球菌和1%谷氨酶（美國吉布科）。根據荷蘭二次使用材料的指南，從一名77歲患者的人類大靜脈中收獲了主要分離的人血管來源的細胞，并接種（0.3×106細胞/厘米2，通道6）使用纖維蛋白作為細胞載體進入瓣膜形支架。將種子構建體與新開發的插入物一起放入DPD生物反應器系統中，該插入物含有補充L-抗壞血酸2-磷酸（0.25mg / mL，美國西格瑪）的生長培養基。脈動流以1 Hz施加到瓣膜的非屏蔽心室側。
使用雙軸拉伸試驗機（生物測試儀，5 N稱重傳感器;cellscale，加拿大滑鐵盧）與 軟件 （V8.01， 細胞標度） 結合使用。兩個方形樣品 （36 mm2每個）每個瓣膜分別從腹部區域對稱切割。使用電子卡尺在3個隨機位置測量樣品厚度并取平均值。將樣品在徑向和圓周方向上等雙向拉伸，應變率高達20%，應變率為每分鐘*。拉伸后，樣品以每分鐘*的應變速率恢復到0%應變，然后休息循環54秒。在測量最終應力之前，用其中5個循環對樣品進行預處理。在徑向和圓周方向上通過每個單獨的數據集擬合高階多項式曲線。組織的剛度由切向模量表示，并定義為在20%應變下與擬合多項式曲線的切線。
為了分析DTEHV疲勞行為隨時間的變化，對閉合體積，泄漏量，心輸出量和有效孔面積進行了線性回歸分析（Prism V6.0d，美國Graphpad），p<0.05的斜率顯著不為零。對時間點進行平均，并用它們的平均值±標準差來表示。
對于生物力學分析，每個閥門的樣品取平均值，并用其平均±標準差表示。各向異性的存在被定義為在徑向和圓周方向上獲得的剛度之間的顯著差異（p < 0.05），使用成對的學生t檢驗（Prism V6.0d，美國Graphpad）進行分析。
計算仿真所建議的改進的心臟瓣膜幾何形狀被成功轉化為物理剛性物體（圖1a），與*相同的幾何形狀相匹配。嵌件的表面是光滑的，孔均勻分布在整個表面上，以使足夠的營養物質交換到支架上。各個柱子之間有足夠的空間來防止培養過程中傳單融合。插入物很好地安裝在DPD生物反應器系統中，而不會阻礙從心室側流向動脈側的脈動流（圖1b）。
生物反應器插入物和具有代表性的DTEHV結果。開發的生物反應器嵌件，用于在培養過程中施加和控制心臟瓣膜幾何形狀（a）。以綠色表示的嵌件位置示意圖，在生物反應器設置內，心臟瓣膜以紅色表示，鎳鈦諾支架為黑色，脈動介質流動為藍色箭頭（b）。從頂部（c）和底部視圖（d）兩張使用插入物培養的基于人類細胞的DTEHV的代表性圖片，顯示大的共置區域和深刻的腹部曲率，與生物反應器插入物的形狀相匹配。
全尺寸圖像在培養的4周內，TEHV的小葉緊緊地壓實在嵌件周圍，以適應施加的幾何形狀。去細胞化后，瓣膜保持其形狀，并且在取出插入物時看不到小葉縮回。配合區域的長度約為5 mm（圖1c），DLEV的腹部區域保持施加的曲率（圖1d）。組織均勻地分布在整個小葉中，沒有任何損傷或其他宏觀可檢測的不規則性。
在流體動力學試驗裝置中，DTEHV（n = 4）經受生理性肺病。一個閥門的代表性圖如圖2所示。總體而言，所有閥門都*打開（圖2 b-2d），并對稱關閉（圖2 e-2f）。在任何瓣膜中均未觀察到脫垂。
生理流體動力學肺體外試驗結果。在1200萬次循環后，DTEHV經受體外流體動力學生理肺搏動刺激的代表性結果顯示功能正常，如圖（a）所示。閥門*打開（b–d）并對稱地關閉（e，f）。
全尺寸圖像對于長期耐久性測定，閥門的打開和關閉行為設置為與流體動力學設置中觀察到的生理行為相當。從進行疲勞試驗的DTEHV（n = 4）中，三個保持功能，長達約1200萬次循環，代表體內隨訪時間16周。一個閥門在400萬次循環中發生故障，并且從一開始就無法在疲勞測試期間保持穩定的壓力條件。隨著時間的推移，閥門的功能沒有下降，初始反流分數為4.13±1.44%，包括關閉體積百分比為3.41±1.42%，泄漏體積百分比僅為0.73±0.08%（圖3a）。閥門保持了 2.37 ± 0.04 cm 的一致有效孔口面積2，隨著時間的推移，心輸出量維持在 4.80 ± 0.11 L/min（圖 3b）。功能喪失是突然的，在所有情況下都是傳單在其中一個委員會點破裂的結果。
DTEHV 在體外的長期功能行為。從開始（n = 4），300萬個周期（n = 4），600萬個周期（n = 3），900萬個周期（n = 2）和1200萬個周期（n = 2）后，反流分數，心輸出量和有效孔面積的間隔測量，顯示反流隨時間沒有顯著增加（p < 0.05） （a）.此外，心輸出量和有效孔口面積也隨時間保持穩定（b）。值表示為±標準差的平均值。
全尺寸圖像對所有DTEHV的樣本進行了組織學檢查。圖4中的代表性照片表明，組織均勻地分布在整個小葉的厚度中。此外，沒有觀察到壞死或受損的組織。去細胞化過程成功地去除了所有細胞，如H&E染色所示，盡管組織中仍然存在支架殘留物（圖4a）。從MTC染色中可以看出，小葉主要由膠原蛋白組成（圖4b），在VvG染色中沒有彈性基質形成的跡象（圖4c），否則黑色纖維會表明這一點。
斷續器的組織學。具有蘇木精和曙紅的DTEHV小葉染色部分的代表性圖像，顯示適當的去細胞化，相等的組織形成和支架殘留物的存在（a）。馬森三色主要顯示藍色（b）中描繪的膠原蛋白沉積，其中彈性范吉森表明結構（c）內沒有彈性基質形成。
全尺寸圖像通過分析膠原整個支架染色，在5個DTEHV小葉的整個半部分上，在約200μm的深度內可視化了全局膠原取向。Z方向上的代表性最大投影如圖5a所示。在這里，膠原蛋白在共適應區域（圖5b）的圓周方向上清晰地對齊，并且更隨機地分布在腹部的底部區域（圖5c）。
膠原蛋白定位。通過心室側共聚焦顯微鏡觀察半個DTEHV小葉上膠原特異性全囊染色的代表性圖像，顯示膠原方向在凝固區域（b）的圓周方向上清晰對齊，并隨機分布到腹部底部（c）。黑點表示焦平面外的局部區域。
全尺寸圖像控制閥的平均拉伸曲線顯示，在20%應變下，徑向方向的柯西應力范圍在200-300 kPa和圓周方向的300-400 kPa之間（圖6a），指示組織各向異性。從所有閥門的平均等雙向拉伸試驗來看，與徑向（p = 0.035）相比，圓周方向的切向模量顯著更高，分別為3.59±0.95和2.47±20%應變時0.74 MPa（圖6b）。
四氫呋喃的機械性能。從對照組的相等雙軸拉伸試驗中獲得的徑向和周向應力-應變曲線顯示柯西應力范圍在200-400 kPa （a）之間。擬合曲線用作計算模擬 （a） 的材料參數。所有DTEHV的計算切向模量顯示，與徑向相比，圓周方向的組織剛度顯著增加（*p = 0.035）（b）。所有值都表示為±標準差的平均值。
全尺寸圖像對照組的實驗拉伸數據擬合數值模型（圖6b），得到以下參數值：\（k_= 2 2. 0\;k_ = 7。5 0, \;} \;\西格瑪 = 6 7.5^{{{循環 } .\）
在平均肺壓差為15 mmHg時，計算模擬顯示，原始設計在加載期間在整個小葉的徑向方向上受到小葉組織壓縮（圖7a）。與原始設計相比，這些DTEHV改進的閥門設計顯示出徑向組織壓縮的顯著降低（圖7b）。圓周方向的應變在兩種設計中都保持了可比性。此外，在改進的設計中，本膠原各向異性對組織負荷的影響顯示，與*各向同性的膠原取向相比，橈骨組織壓縮沒有變化（圖7c）。
計算模擬。將DTEHV的材料參數實施到已建立的計算瓣膜模型中，以評估原始和改進的瓣膜設計中徑向和周向的應變，模擬15 mmHg的平均肺壓。在最初的瓣膜設計中，整個小葉組織在徑向（a）上被壓縮。改進的閥門設計顯示腹部徑向壓縮（b）顯著降低，這主要是由于幾何改善而不是膠原各向異性（c）。圓周方向的應變在兩種閥門設計之間是可比的。
全尺寸圖像從我們第一次在綿羊中植入DTEHV的長期體內實驗開始，我們觀察到小葉與壁融合，這導致隨著時間的推移瓣膜功能不全的發展。6，30 根據計算模擬，假設必須調整原始的DTEHV幾何形狀，以便在徑向方向上擴展傳單，而不是壓縮。因此，開發了一種生物反應器插入物，以在培養過程中施加所需的瓣膜幾何形狀，該幾何形狀在去細胞化和去除插入物后保持。這導致DTEHV具有增加的配合面積和顯著的徑向和圓周腹部曲率。
通過引入約束插入物來調整生物反應器系統中的培養條件可能通過限制營養和氧交換而影響了組織的形成。然而，這些DTEHV似乎仍然在整個小葉厚度中含有均勻的ECM分布，主要由膠原蛋白組成。這些組織學發現與先前培養的基于人類細胞的TEHV一致，該TEHV具有原始的閥門幾何形狀，而沒有插入物。17
此外，引入插入物會進一步影響全局膠原蛋白的方向。在組織培養過程中，已知無紡布PGA網格會水解，從而失去其機械完整性和結構支撐。9，19，23 這種降解曲線與細胞施加的張力相結合，導致組織在無約束方向上壓實，從而導致沿約束方向的膠原取向。4，18
在這項研究中，使用針對剛性物體的組織壓實來根據生物反應器插入物的形狀施加DTEHV幾何形狀。培養2周后，支架失去其機械完整性，組織開始致密。29 在壓實時，小葉組織受到剛性生物反應器插入物的約束，但小葉游離邊緣的組織在徑向方向上仍可能略微壓實。這導致在凝固區域主要是圓周對齊的膠原蛋白，并且更隨機地分布在腹部底部。
其他使用約束方法來控制DTEHV幾何形狀的研究很有希望，但是到目前為止還沒有報道高達1200萬次循環的長期功能。18，24–26，28 本研究中產生的DTEHV在反流、心輸出量和打開和關閉行為方面顯示出長達16周的體內模擬的令人滿意的長期功能，只有一個瓣膜在400萬次循環后失效，無法在疲勞測試期間適應和穩定施加的肺壓條件。從先前在綿羊和非人靈長類動物中的體內植入研究中，在5小時內觀察到宿主細胞再繁殖，伴有8周后細胞外基質的變化，并有證據表明這些細胞產生ECM。6，30 因此，本研究中開發的DTEHV在生理性肺條件下應具有足夠的抗疲勞性，以便為宿主細胞重新填充和維持ECM提供足夠的時間。
除了在大的共置面積和增強的腹部曲率方面改善瓣膜幾何形狀外，膠原各向異性對于在動態加載期間獲得徑向小葉拉伸至關重要，這是天然小葉的特征，2由于菌株誘導的膠原重組而導致體內植入后的各向異性進一步增加。4 與報告的剛度值相比，1人本體主動脈瓣瓣小葉在徑向和周向的切向模量分別為約2.0±1.5和15.6±6.4 MPa。報告的徑向DTEHV的切向模量與2.5±0.7 MPa相當，但在圓周方向上較低，為3.6±1.0 MPa。
盡管局部觀察到的膠原各向異性差異沒有實現到模型中，但這些計算模擬表明，整體膠原各向異性的額外效應似乎不會影響肺負荷條件下的組織負荷行為。因此，僅實施的幾何改進就足以防止整個瓣膜幾乎*受到徑向組織壓迫。
使用DTEHV進行人類應用的概念在再生能力和增長潛力方面仍然有很大的希望，這將克服對年輕患者進行多次再干預的必要性。不需要使用自體細胞，可以使用異體細胞來簡化法規并允許現成的可用性。進一步開發適用于微創心臟瓣膜植入的生物降解支架應成為未來研究的重點，以完成生長瓣膜概念。
總之，本研究提出了一種成功的解決方案，通過在培養過程中使用約束性生物反應器插入物來施加所需的三維彎曲組織工程瓣膜幾何形狀，從而允許在去細胞化和去除插入片段后保持形狀。這導致了*有能力的現成的基于人類細胞的DTEHV，具有較大的共置面積和深刻的腹部曲率。長期功能主要維持長達16周的體內模擬，為宿主細胞的再繁殖留出了足夠的時間。使用生物反應器插入物導致均勻分布的組織形成，共適區域的圓周膠原取向以及整個小葉組織各向異性。基于力學數據，我們的計算模型顯示，通過獲得的幾何調整，橈骨組織壓縮顯著降低。因此，這些改善的DTEHV預計不易發生宿主細胞介導的小葉縮回，并且在植入后仍將保持能力。
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